Tipos de hemólisis y pruebas relacionadas

El Agar Sangre (AS) es una combinación de un agar base (agar nutritivo, Columbia o Tripticasa Soja) como fuente proteica (digeridos trípticos, digeridos proteicos de soja) el cual tiene un agregado de 5 % de sangre ovina, (también puede usarse sangre humana, para cultivo de Gardnerella por ejemplo) con una pequeña cantidad de hidratos de carbono naturales y cloruro sódico.

Permite el crecimiento tanto de microorganismos exigentes como no exigentes, que incluyen bacterias aerobias y anaerobias, así como las levaduras del género Candida, a partir de una gran variedad de muestras.

Una característica fundamental es que permite determinar la capacidad de algunas bacterias de producir enzimas extracelulares, llamadas hemolisinas,  que actúan sobre los glóbulos rojos, produciendo lisis parcial o completa de los mismos. Los diferentes tipos de hemolisis y las pruebas que aprovechan esta característica, son muy útiles en la practica diaria.

 

Tipos de hemólisis

Beta hemólisis

Se produce por la lisis total de los eritrocitos y el secuestro de hemoglobina en el medio, dando zonas incoloras alrededor de las colonias que la producen.

Beta hemólisis

Beta hemólisis

Ejemplos de bacterias betahemolíticas son los Estreptococos Beta hemolíticos como S. pyogenes (grupo A), S. agalactiae (grupo B), S. dysgalactiae y S.  anginosus (grupos C y G), Enterococcus faecalis (hemolisis variable), Staphylococcus aureus, Listeria monocitogenes, Aeromonas sp, y Clostridium prefringens.

Streptococcus pyogenes

Produce una hemolisis muy intensa alrededor de sus colonias pequeñas y puntiformes, debido a que posee dos tipos de hemolisinas llamada Estreptolisinas O y S, que son además factores de virulencia. La estreptolisina O es una hemolisina que libera al medio y que es lábil frente al oxígeno, ademas de ser muy inmunogénica (prueba de anti Estreptolisina O, ASTO). La estreptolisina S es una hemolisina adherida a la célula y estable frente al oxígeno, no es inmunogénica.

Debido a que la Estreptolisina O es inestable ante el oxigeno, es muy útil sembrar los hisopados de fauces en profundidad del Agar Sangre, realizando cortes en el medio, para evidenciar su presencia.

Cortes en agar sangre y estreptolisina O de S. pyogenes

Cortes en agar sangre y estreptolisina O de S. pyogenes

 

Streptococcus agalactiae

A diferencia de S. pyogenes forma colonias más grandes, con una beta hemólisis más tenue, lo que dificulta su hallazgo para operadores inexpertos.

Una prueba fundamental para su identificación es la prueba de CAMP. Esta detecta el factor CAMP, que es una hemolisina termoestable de S. agalactiae que mojora la hemolisis de los eritrocitos producida por S. aureus.

Para ello se realiza una estría en forma de linea con la cepa de S. aureus ATCC 25923, y en forma perpendicular y sin tocar esta ultima, se hace una estría en forma de linea con la cepa a estudiar. La prueba es positiva si aparece hemolisis en “punta de flecha” en la zona de unión de S. aureus y S. agalatiae.

Prueba de CAMP positiva. Observe la "punta de flecha"

Prueba de CAMP positiva. Observe la “punta de flecha”

 

Listeria monocytogenes

Crece bien en Agar Sangre dando colonias grises y beta hemoliticas, gracias a su enzima listeriolisina O, exotoxina hemolítica y citolítica, es un factor crítico de virulencia de L. monocytogenes.

Se puede realizar la prueba de CAMP, pero en este caso no se observa  punta de flecha, sino hemolisis en “cabeza de fósforo” algo difusa.

Prueba de CAMP positiva Listeria monocytogenes

Prueba de CAMP positiva Listeria monocytogenes

 

Clostridium perfringens

Este bacilo positivo anaerobio estricto, puede formar colonias en 18-24 hs en agar sangre, que producen un típico halo de doble hemólisis, una interna de hemólisis completa (ß-hemólisis) debida a la toxina theta y otra externa, más grande, de hemólisis incompleta (a-hemólisis) debida a la toxina alfa.

Para diferenciarlo de otro Clostridios se realiza la prueba de CAMP reversa. Para ello se realiza una estría en forma de linea con la cepa de S. agalatiae, y en forma perpendicular y sin tocar esta ultima, se hace una estría en forma de linea con la cepa a estudiar. Luego de incubar 24-48 hs en anaerobios, la prueba es positiva si aparece hemolisis en “punta de flecha” en la zona de unión de S. agalatiae y Clostridium perfringens.

Prueba de CAMP reversa para Clostridium perfringens

Prueba de CAMP reversa para Clostridium perfringens

 

Aeromonas sp

Otro caso que hay que mencionar es el de Aeromonas. Estos bacilos negativos que pueden provocar gastroenteritis, pueden ser aislados de coprocultivos gracias a su capacidad de producir beta hemolisis en agar sangre.

 

Alfa hemolisis

En este caso se trata de una hemólisis parcial que genera una zona de color “verde” alrededor de las colonias, asociado con la reducción de la hemoglobina de los glóbulos rojos . La Alfa hemólisis es causada por el peróxido de hidrógeno producido por la bacteria , y a la posterior oxidación de la hemoglobina a metahemoglobina verde.

Ejemplos de bacterias alfahemolíticas son Streptococcus pneumoniae (Neumococo), Streptococcus viridans, Enterococcus faecium, Lactobacillus sp., Corynebacterium sp.

Alfa hemolisis

Alfa hemolisis

 

Streptococcus pneumoniae

El neumococo es el principal agente de la Neumonia de la comunidad, y podemos aislarlo en el laboratorio gracias a sus características morfológicas como son sus colonias grandes y aplanadas, en ocasiones mucosas (capsula) y a su característica alfa hemolisis.

S. pneumoniae, cepa mucosa

S. pneumoniae, cepa mucosa

 

Gamma hemólisis

Las colonias gamma hemoliticas no muestran ni alfa ni beta hemolisis, pero sin embargo, puede haber una ligera decoloración en el medio .

Ejemplos de bacterias gamma hemoliticas son la mayoría de las Enterobacterias, Enterococcus faecalis (variable), Estafilococos coagulasa negativos.

Gamma hemólisis

Gamma hemólisis

 

 

M. Cifarelli

M. Cifarelli

Es Bioquimico de la Universidad Nacional del Sur (Bahia Blanca). Matricula Nacional: 10278.
Realizo la Residencia en Bioquímica Clínica en el Hospital de Clínicas – UBA. Contacto: mdcifarelli@gmail.com

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