Hodge mejorado para detección de carbapenemasas

La detección de bacilos Gram negativos productores de carbapenemasas es de suma importancia para el control de infecciones nosocomiales, y para iniciar una terapia antimicrobiana adecuada.

La prueba de Hodge modificada (MHT), un método microbiológico de inactivación de antibióticos, ha mostrado poca sensibilidad en la detección de la metalo- betalactamasa New Delhi (NDM). Estudios recientes demostraron que NDM es una lipoproteína que se ancla en la membrana externa de las bacterias Gram negativas, a diferencia de todas las demás carbapenemasas. Ese anclaje de membrana dificulta la detección de la actividad carbapenemasa por el método de Hodge modificado MHT. Esta limitación se puede superar mediante la adición de Triton X-100 durante la prueba. Es una versión mejorada del ensayo, llamada Triton Hodge Test (THT) o Test de Hodge Mejorado, que permite la detección de todas las carbapenemasas, gracias a la adición de este tensioactivo no iónico.

 

carbapenemasas

 

La prueba de Hodge mejorada para detección de carbapenemasas fue desarrollada por Fernando Pasteran y col. del Servicio de Antimicrobianos, ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán, y el Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario, Santa Fé.

Alejandro Vila, director del Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario, comenta:

Apenas le conté a los colegas del Malbrán la primicia del hallazgo en NDM-1, ellos se dieron cuenta que esa era la causa de la falla del método de detección, así que pudimos en colaboración desarrollar una nueva metodología, que fue publicada en el Journal of Clinical Microbiology. Fue una satisfacción muy grande ver que un descubrimiento básico pueda haber tenido una aplicación en la clínica en tan corto plazo, y es un gran mérito de mis colegas de Malbrán”

 

El método mostró una sensibilidad mayor al 90% en la detección de cepas productoras de NDM de aislamientos clínicos, al tiempo que mejora el rendimiento frente a otras carbapenemasas, de entre el 92,5 al 100%, dependiendo del tipo de carbapenemasa y el carbapenem ensayado, y una especificidad entre 87,5 y 92,5% con Ertapenem y Meropenem, respectivamente.

Esta prueba, simple y de bajo costo, confiere una gran mejora a la sensibilidad del método MHT para la detección de NDM y otras carbapenemasas.

 

Alcance del ensayo

Permite la detección de carbapenemasa tipo NDM y demás carbapenemasas de importancia clínica: KPC, otras MBLs y OXA-48-like. Se pueden evaluar todos los bacilos Gram negativos.

 

Materiales necesarios

  • Detergente no ionico TritonX-100 de origen comercial
  • Discos de Meropenem y Ertapenem
  • Cepa indicadora E. coli ATCC 25922
  • Placa de Mueller-Hinton (MH) para ATB de 4 mm de espesor.

 

Procedimiento por método de inundación

1. Eliminar la humedad de la superficie de una placa de MH por evaporación en estufa a 35º .

2. Agregar 50 microlitros de TritonX-100 en la superficie de la placa de MH. Rápidamente distribuir con un hisopo el detergente en toda la superficie hasta su absorción completa (entre 4 -6 hisopados en todas las direcciones)*

3. Eliminar nuevamente la humedad de la placa por evaporación a 35º.

4. Realizar una suspensión 0.5 Mac Farland de la cepa indicadora (Escherichia coli ATCC® 25922)

5. Con hisopo extender el inóculo de la cepa indicadora sobre la superficie de la placa, siguiendo las recomendaciones del CLSI para el método de antibiograma por difusión.

6. Coloque en el centro de la placa un disco de carbapenem. El carbapenem indicado varía según la especie bacteriana de la cepa incógnita:

  • Klebsiella y Enterobacter spp: Meropenem
  • Enterobacterias distintas de Klebsiella y Enterobacter spp: Ertapenem
  • BNNF: podrá utilizarse indistintamente Ertapenem o Meropenem.

7. Con un ansa estéril tomar entre 3 y 5 colonias de un cultivo fresco de la cepa en estudio y realice una estría desde el borde del disco hacia la periferia de la placa (la longitud puede ser de 20-25mm aproximadamente). Podrán ensayarse simultáneamente hasta 4 cepas incógnitas por placa.

8. Incubar la placa en aerobiosis a 35ºC durante 16-18 horas.

9. Interpretar los resultados:

  • THT positivo: se observara un sobrecrecimiento de la cepa indicadora hacia el disco de carbapenem en la intersección de la estría con la zona de inhibición.
  • THT negativo: se observara la zona de inhibición inalterada en su intersección con la estría de la cepa incógnita.
  • THT indeterminado: se observara una zona clara a lo largo de la estría de la cepa incógnita. Esto se debe a que algunas cepas pueden producir sustancias que inhiben el crecimiento de E. coli ATCC® 25922.

 

*  Las placas de MH suplementadas con TirtonX-100 podrán ser preparadas con anterioridad al ensayo y almacenadas a 4ºC por lo menos 2 meses antes de su uso. Una alternativa al método de inundación, es agregar directamente el TritonX-100 durante la preparación del MH, previo a la esterilización por calor (concentración final de TritonX-100: 0.1 % vol/vol).

 

Resumen

Sin título-1

 

Resultados

Falsos negativos usando MHT resueltos utilizando el THT para cepas productoras de NDM

Hodge NDM-1

Cepas: P. rettgeri M15973, K. pneumoniae M17047, A. baumannii M17232 y K. pneumoniae M17277.

Este articulo no pretende reemplazar los datos, directrices, ni boletines del Servicio de Antimicrobianos - INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, sino sólo difundir información relevante para la oportuna detección de los mecanismos de resistencia microbiana, en laboratorios de bacteriología clínica.

 

Fuentes de información:

 

 

M. Cifarelli

M. Cifarelli

Es Bioquimico de la Universidad Nacional del Sur (Bahia Blanca). Matricula Nacional: 10278.
Realizo la Residencia en Bioquímica Clínica en el Hospital de Clínicas – UBA. Contacto: mdcifarelli@gmail.com

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