Detección fenotipica de carbapenemasas en enterobacterias.

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La resistencia a betalactámicos, se puede producir por varios mecanismos, pero el más importante por su frecuencia y eficacia es la producción de betalactamasas. Los genes que codifican estas enzimas pueden encontrarse en el cromosoma o en plásmidos y pueden producirse de manera constitutiva o inducible.

En los últimos años se ha producido una gran alarma y preocupación por la gran dispersión de los bacilos gramnegativos resistentes a los carbapenémicos en los que el mecanismo implicado es la producción de betalactamasas capaces de hidrolizar este grupo de antimicrobianos y que se han asociado a elementos genéticos trasferibles. Estas enzimas se denominan genéricamente carbapanemasas y se agrupan en las diferentes clases moleculares de Ambler que se corresponden con diferentes grupos funcionales de la clasificación de Bush y Jacoby del año 2010. En la siguiente tabla se clasifican estas enzimas, indicando las más relevantes y los microorganismos en los que se encuentran habitualmente.

 

Carbapenemasas clasif

 

> El grupo más importante de carbapenemasas son las de clase A (grupo 2f). La primera carbapemasa de clase A descubierta era de naturaleza cromosómica y fue detectada por vez primera en 1982, incluso antes de la comercialización de los carbapenémicos. Esta enzima, denominada SME, se encontró en S. marcescens y después en E. clocae tanto en casos esporádicos como asociados a pequeños brotes epidémicos. Existen al menos tres variantes (SME-1, -2 y -3) que confieren un fenotipo con pérdida marcada de sensibilidad a los carbapenémicos y un perfil hidrolítico que incluye el aztreonam y en menor medida o inexistente a las cefalosporinas de tercera y cuarta generación. No son inhibidas por el EDTA pero como peculiaridad destaca la inhibición parcial por ácido clavulánico (mejor con tazobactam). Otras enzimas relacionadas son las de los grupos IMI (IMI-1 y -2) y NMC-A encontradas inicialmente en diferentes especies del género Enterobacter.

No obstante, dentro de las carbapenemasas de clase A, las que mayor importancia epidemiológica tienen son las denominas KPC que reciben este nombre por haberse encontrado inicialmente en K. pneumoniae (KPC = K. pneumoniae carbapenemases). Las enzimas KPC se han descrito no solo en Enterobacteriaceae sino también en P. aeruginosa y en A. baumannii. Desde el punto de vista fenotípico, las enzimas KPC hidrolizan de forma eficiente penicilinas, cefalosporinas y carbapenémicos. Como excepción tendrían una menor tasa de hidrólisis de las cefamicinas (cefoxitina) aunque los valores de CMI que se obtienen suelen estar por encima del punto de corte de sensibilidad. No se inhiben por el ácido clavulánico pero si por el ácido borónico, inhibidor que se utiliza para el reconocimiento fenotípico. No obstante, la inhibición por el ácido borónico no es exclusiva de las enzimas KPC ya que también es un inhibidor eficiente de las betalactamasas de tipo AmpC (Clase C de Ambler y grupo 1 de Bush y Jacoby) y que con la excepción del enzima CMY-10 no hidrolizan carbapenémicos.

Dentro de las carbapenemasas de clase A deben citarse también algunas variantes de las BLEE de tipo GES como GES-4 encontrada en P. aeruginosa, Acinetobacter spp. y en enterobacterias que hidroliza de forma eficiente penicilinas y cefalosporinas y muy débilmente a los carbapenémicos. Su importancia epidemiológica es mucho menor que las KPC.

 

> Las metalo-betalactamasas, clase B o grupo 3 de Bush y Jacoby, fueron las primeras carbapenemasas de origen plasmídico que se describieron, fue en Japón en el año 1991 en P. aeruginosa. A esta enzima se la denominó IMP-1 y el gen responsable se encontró localizado en un integrón incluido en plásmidos trasferibles. En la actualidad se conocen hasta 29 variantes en el grupo de las enzimas IMP y se han descrito con más frecuencia en P. aeruginosa que en las enterobacterias. Asimismo, en el año 1997 se detectó en Italia, también en P. aeruginosa, una enzima, igualmente de clase B, de carácter transferible que recibió el nombre de VIM-1 y cuyo gen se asocia a integrones de clase 1.

Las enzimas IMP y VIM tienen un perfil hidrolítico que incluye todos los antibióticos betalactámicos con la excepción del aztreonam y no se inhiben por el ácido clavulánico, sulbactan y tazobactam. Sin embargo se inhiben por agentes quelantes de cationes divalentes como el EDTA, compuestos tiólicos como el ácido 2-mercaptopropiónico, o el ácido dipicolínico.

Con características similares se han descrito con posterioridad enzimas de los grupos SPM, GIM, SIM, AIM, DIM y KHM, y más recientemente la enzima NDM-1 que ha creado una importante alarma mediática debido al perfil mutirresistente o panresistente de los aislados que la producen.

 

> Por ultimo, en el grupo de las OXA (clase D de Ambler y 2df de Bush y Jacoby) también se encuentran variantes que hidrolizan los carbapenemes. Entre ellas se destacan las variantes de los subgrupos OXA-23, OXA-24, OXA-58, OXA-143 y, en menor medida, OXA-51 descritas en Acinetobacter spp. y sobre todo la OXA-48 descrita en enterobacterias en países del entorno mediterráneo.

La detección fenotípica de OXA-48 es compleja ya que la hidrólisis de los carbapenémicos es poco eficiente y prácticamente inexistente para las cefalosporinas de tercera y cuarta generación. El perfil de sensibilidad que confieren mantiene las características generales de las OXA al ser poco inhibida por el ácido clavulánico, sulbactam o tazobactam. Por ello, en un antibiograma habitual de K. pneumoniae o E.coli,  enterobacterias en las que mayoritariamente se ha encontrado la OXA-48, se mostrarían resistentes a las penicilinas y sus asociaciones con los inhibidores de betalactamasas de clase A, serían sensibles a las cefalosporinas y mostrarían pérdida de sensibilidad a los carbapenémicos.

Recientemente se ha comunicado en E. coli, K. pneumoniae y E. cloacae un nuevo enzima tipo OXA, OXA-181 que deriva de OXA-48 pero que tendría un perfil hidrolítico más amplio que ésta.

 

Detección de carbapenemasas.

Antes de comenzar cabe aclarar que previo a la interpretación de los resultados de un estudio de sensibilidad es necesario conocer la identificación del microorganismo. Cada bacteria o grupo bacteriano tiene su patrón de resistencia natural que hay que tener presente en este proceso.

Para la detección fenotípica de las carbapenemasas se debe tener en cuenta la posible presencia de otros mecanismos de resistencia que puedan “enmascarar” el fenotipo que confieren las cabapenemasas, entre ellos la alteración de la permeabilidad, la presencia de bombas de expulsión, afectación de las PBPs o presencia simultánea de otras betalactamasas.

La metodología descripta a continuación es la recomendada por Pasteran y col. del Servicio de Antimicrobianos Anlis-Malbran para nuestro país.

1) Lo primero que debemos observar es el halo de IMIPENEM (IMI): si es ≤ 22 mm sospechamos la presencia de carbapenemasas.
Para Salmonella spp el punto de corte de sospecha de carbapenemasa es ≤ 24 mm.
Los microorganismos de la Tribu Proteae (Proteus spp, Providencia spp, Morganella morganii) naturalmente poseen bombas de eflujo que extraen IMI y hacen que los halos para este ATB sean ≤ 22mm. En estos casos se tendrán en cuenta el halo de Meropenem (MER) ≤ 27 mm, además de IMI ≤ 22 mm para la sospecha de carbapenemasas.

 

2) Si en el antibiograma primario sospechamos la presencia de carbapenemasas según los puntos de corte establecidos para los diferentes microorganismos, se debe realizar una placa complementaria para la observación de las sinergias con ácido borónico (APB) y con EDTA/SMA, según el siguiente esquema de colocación de discos:

 

colocacion de discos

– La distancia de colocación de los discos MER – APB – IMI se calcula en base a los diámetros de inhibición obtenidos en el antibiograma primario, según la siguiente fórmula:
                                                   Radio del antibiótico 1 (ATB1) + Radio del antibiótico 2 (ATB2) + 5 mm

Ej: E. coli con halos IMI= 18 mm y MER= 18 mm. Al ser iguales ambos diámetros realizamos un sólo cálculo, que según la fórmula sería:
Radio ATB1 + Radio ATB2 (radio del inhibidor*) + 5 mm= 9 + 3 + 5= 17 mm.
* El diámetro del inhibidor (APB o EDTA) se considera 06 mm ya que no presenta halo de inhibición.

Se debe colocar el disco de APB a 17 mm de centro a centro de cada disco de carbapenem (IMI y MER)

– La distancia entre los discos IMI – EDTA/SMA – C3G+CLAV será ajustada utilizando la misma fórmula.
Las C3G constituyen mejores sustratos que los carbapenemes para las MBL, por ello se utilizan en la prueba de sinergia. La C3G combinada con ácido clavulánico (CLAV) (ej: CTX/CLAV) sería más adecuada para la detección de la MBL debido a que se eliminaría un posible efecto de ocultación de la MBL mediado por la presencia de BLEEs. Recordemos que la mayoría de las BLEEs epidemiológicamente importantes en nuestro país son inhibibles por CLAV. Al utilizar dicha combinación se inhibiría la BLEE y quedaría expuesta la actividad de la MBL.

3) Análisis del resultado de las sinergias y de la resistencia (R) a Cefalosporinas de 3ª generación (C3G): Cefotaxima (CTX), Ceftazidima (CAZ). En base a esto podremos sospechar la presencia de los distintos tipos de carbapenemasas u otros mecanismos de resistencia, como vemos en el siguiente diagrama:

algor carbap final

 

Recordar que puede haber otros mecanismos de resistencia no mediados por carbapenemasas que pueden producir el fenotipo de resistencia a carbapenemes:

1) Betalactamasa de espectro extendido (BLEE) tipo CTX-M + impermeabilidad: la suma de estos dos mecanismos de resistencia pueden dar R a los carbapenemes.

Fenotípicamente observaremos:
– Sinergia IMI- APB: NEGATIVA
– Sinergia IMI – EDTA/SMA – C3G/CLAV : NEGATIVA
– Sinergia C3G y C4G con CLAV: positiva (BLEE+) (halos de CTX mucho más pequeños que los de CAZ)
Escaleras fenotípicas: los carbapenemes se afectan de diferente manera frente al mecanismo de R, dando halos de inhibición en escalera:
IMI (>21 mm) > MER > ERT (6mm)

Criterio de informe en fenotipos puros (sólo presencia de BLEE):
– CARBAPENEMES: según el fenotipo (R, I, S)
– C3G y C4G: R
– AZT: R

2) AmpC (derreprimido) + impermeabilidad: la suma de estos dos mecanismos de resistencia pueden dar R a los carbapenemes.

Fenotípicamente observaremos:
– Sinergia IMI- APB: POSITIVA en Enterobacter cloacae y Citrobacter freundii (falsos positivos para carbapenemasa 2f); NEGATIVA en   M. morganii, Providencia spp, S. marcescens
– Sinergia IMI – EDTA/SMA – C3G/CLAV : NEGATIVA
Escaleras fenotípicas: MER > IMP ( < 22mm) >ERT (6 mm).

Por ultimo no se recomiendan los métodos microbiológicos para confirmación de actividad enzimática (carbapenemasa) en enterobacterias debido a que tienen baja especificidad (falsos positivos debidos a otras enzimas no verdaderas carbapenemasas).

Este articulo no pretende reemplazar los documentos ni tablas originales extraídos de la publicaciónes del CLSI, ni de los boletines del Servicio Antimicrobianos – INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, sino sólo ser una herramienta para quienes se desempeñan en bacteriología clínica.

 

 
Fuentes de información:
– Detección fenotípica de mecanismos de resistencia en gramnegativos. Jorge Calvo. Recomendaciones SEIMC.
– Bibliografía del Servicio Antimicrobianos INEI-ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”.
 
 

 

M. Cifarelli

M. Cifarelli

Es Bioquimico de la Universidad Nacional del Sur (Bahia Blanca). Matricula Nacional: 10278. Realizo la Residencia en Bioquímica Clínica en el Hospital de Clínicas - UBA. Contacto: mdcifarelli@gmail.com

1 respuesta

  1. MARTHA ATUN dice:

    MUY BUENO,CLARO Y CONCISO

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